Diagnóstico Microbiológico en la Detección e Identificación de Staphylococcus

El método estándar para la detección e identificación de Staphylococcus incluye el cultivo en una placa de agar sangre no selectiva, así como en caldo de enriquecimiento, seguido por procedimientos bioquímicos y otros relacionados, incluyendo el uso de sistemas comerciales para fines de identificación.

Desde un punto de vista diagnóstico y clínico, es un requisito esencial hacer una distinción clara y válida entre especies de SCN y especies de SCP, formado este último grupo prácticamente por S. aureus en especímenes clínicos humanos. Entre SCN, el reconocimiento exacto de S. lugdunensis es de particular importancia.

El problema más difícil en el diagnóstico de SCN es la evaluación de su relevancia clínica. Por lo tanto, la tarea diagnóstica principal es evaluar si un aislado de SCN representa 1) una contaminación de la muestra durante el muestreo y el procesamiento, 2) la colonización fisiológica de la piel o las membranas mucosas, o 3) una infección clínicamente significativa. Esta difícil situación se vuelve aún más complicada en el caso de las infecciones polimicrobianas por SCN, en particular para la elección de antibióticos para la terapia si los aislamientos presentan diferentes patrones de susceptibilidad.

Los diferentes métodos de identificación de Staphylococcus se basan en las enzimas y las toxinas que producen y en su material genético. Los principales métodos (medios de cultivo, pruebas bioquímicas, análisis molecular y espectrometría de masas) se describen a continuación:

Medios de cultivo

• Agar Columbia con 5% de sangre de cordero. Es un medio muy nutritivo de uso general para el aislamiento y el cultivo de microorganismos exigentes y no exigentes a partir de muestras clínicas. Este medio propicia el crecimiento por la combinación de dos peptonas y del extracto de levadura como fuente de vitaminas del complejo B. Además, se incluye almidón de maíz para absorber los derivados tóxicos contenidos en la muestra y sirve como fuente de energía para los microorganismos que poseen α-amilasas. La sangre de carnero permite detectar las reacciones hemolíticas y aporta el factor X (hemo) necesario para el crecimiento de numerosas especies patogénicas. En este medio, las colonias suelen ser más grandes y el crecimiento más profuso que en otros que contienen diferentes bases de agar sangre. En muchos países europeos, el agar sangre Columbia se ha convertido en el medio de aislamiento primario más frecuentemente utilizado para las muestras clínicas.
• Agar Baird-Parker. Es un medio excelente para el recuento de S. aureus, además, es el medio moderadamente selectivo más utilizado. Su composición consta de piruvato sódico, el cual ayuda a recuperar las bacterias lesionadas; y su poder selectivo se debe a la presencia de telurito, cloruro de litio y glicina. La presencia de S. aureus se evidencia por su aspecto negro, debido a la reducción del telurito, con un halo transparente que revela la actividad lipolítica sobre la yema de huevo; sin embargo, las colonias deben confirmarse con un Gram.
• Agar salado manitol. Se emplea para aislamiento selectivo. El agar sal manitol contiene una concentración de NaCl de 7.5%, el cual es el agente activo del medio e inhibe parcial o completamente a los organismos bacterianos diferentes de los estafilococos. Los SCP producen colonias de color amarillo y un medio circundante de color amarillo, mientras que los SCN producen colonias de color rojo, por tanto, no provocan cambios en el color del indicador rojo fenol.
• Agar estafilococos N° 110. Es un medio selectivo para aislar estafilococos patógenos a partir de muestras clínicas y no clínicas, basado en la fermentación de manitol, la formación de pigmento y la actividad gelatinasa. Este medio también se utiliza para el aislamiento de estafilococos que contaminan una amplia variedad de alimentos y producen una intoxicación alimentaria. Los SCP patógenos crecen en altas concentraciones de NaCl y forman colonias amarillas y doradas. Por otra parte, la fermentación de manitol se detecta por medio de la adición de unas gotas de azul de bromotimol a la placa, buscando las colonias con un halo amarillento alrededor. Los estafilococos licuan la gelatina produciendo zonas claras alrededor de las colonias. Para esta prueba, se le agrega a la placa Petri 5 ml de una solución saturada de sulfato de amonio o adicionando una gota de ácido sulfosalicílico al 20% e incubando 12 minutos para observar la hidrólisis de la gelatina. Una zona clara-transparente alrededor de la colonia constituye una hidrólisis positiva (Stone’s reaction).
• Agar DNAsa. Es utilizado para identificar estafilococos potencialmente patógenos; manifiesta la actividad de la desoxirribonucleasa, la cual es indicadora de su patogenicidad. Asimismo, se investiga la capacidad del microorganismo de producir enzimas que hidrolicen el ADN. La aparición de halos transparentes alrededor del área de crecimiento se considera resultado positivo, ya que estas corresponden a zonas de hidrólisis del ADN.

Pruebas bioquímicas

• Prueba de la catalasa. Se utiliza para probar la capacidad del microorganismo para producir la enzima catalasa, la cual facilita la conversión de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, siendo de utilidad para evitar la formación de radicales tóxicos por el sistema de la mieloperoxidasa en las células fagocíticas. La prueba es positiva cuando la bacteria reacciona produciendo la liberación de burbujas, que es la característica dada por la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno80. Es la prueba estándar para diferenciar los estafilococos (catalasa positivos) de los estreptococos (catalasa negativos).
• Prueba de la coagulasa. Es el método tradicionalmente utilizado en el laboratorio clínico para la diferenciación de S. aureus (pero más ciertamente todos los SCP) y los SCN. La coagulasa es un factor de agregación y constituye una prueba muy sensible y específica para esta bacteria. Esta proteína representa un importante factor de virulencia. La coagulasa puede unirse al fibrinógeno y convertirlo en fibrina insoluble, la cual tiende a formar depósitos donde los estafilococos pueden agregarse. La prueba puede hacerse de dos maneras: en portaobjeto, en la cual la solución se ha tratado previamente con EDTA y plasma de conejo. Por otra parte, la prueba se puede realizar en tubo, para lo cual se inoculan 0.5 ml de una dilución de plasma de conejo con la colonia sospechosa.
• Prueba de la novobiocina. En el caso de aislados de SCN recuperados de muestras de tracto urinario, la prueba de resistencia a la novobiocina se utiliza de forma rutinaria y casi exclusivamente como un método simple para distinguir S. saprophyticus subsp. Saprophyticus, intrínsecamente resistente a novobiocina, de otros SCN clínicamente importantes del grupo de S. epiEpidemiología, diagnóstico y tratamiento de bacterias del género Staphylococcus dermidis. Otros SCN resistentes a novobiocin se encuentran muy raramente en especímenes de origen humano. El método utilizado se basa en la prueba de difusión en disco, utilizando un disco de novobiocina de 5 μg en agar Mueller-Hinton o agar sangre.
• Sistemas comerciales. Estos sistemas siguen siendo la piedra angular de muchos laboratorios de rutina y comprenden los sistemas de identificación específicos de Staphylococcus como API Staph, ID Staph strips y Rapidec Staph (bioMérieux), así como sistemas generales como Vitek 2 (bioMérieux), Pos ID Panel family (Siemens Healthcare Diagnostics), BBL Crystal identification system’s Rapid Gram-Positive ID kit (BD Diagnostic Systems), Phoenix automated microbiology system (BD Diagnostic Systems) y Biolog systems (Biolog Hayward). Estos sistemas son bastante exitosos en la diferenciación de S. aureus y SCN comunes como S. epidermidis, S. haemolyticus y S. saprophyticus, mientras que la identificación exacta de especies menos comunes, especialmente S. hominis y S. warneri, es más variable. La prueba de compuestos orgánicos volátiles en muestras clínicas parece ser una herramienta futura prometedora para la detección no invasiva y el monitoreo de enfermedades infecciosas. Se basa en perfiles biomarcadores que representan los metabolitos tanto del patógeno infeccioso como de las respuestas del huésped inducidas por los patógenos.

Análisis molecular

• PFGE (electroforesis en gel de campo pulsado). Actualmente, se considera el estándar de referencia para tipificar aislamientos de MRSA y ha demostrado ser uno de los métodos para estudiar epidemias e infecciones tipo hospital- hospital. La tipificación PFGE de MRSA se fundamenta en la digestión de DNA cromosomal purificado con la enzima de restricción SmaI, para un posterior migración y visualización en geles de agarosa. Posteriormente, los patrones de migración se analizan con el coeficiente de dados y se realiza una búsqueda de compatibilidades (UPGMA), según los esquemas de Tenover.
• MLST (tipificación de secuencias multilocus). Constituye una excelente herramienta para investigar la evolución de los clones de MRSA. La técnica se basa en el análisis de siete secuencias de fragmentos de 0.5 kbp de genes Housekeeping: arc, aro, glp, gmk, yqi, pta y tpi. Se asignan diferentes secuencias a los alelos de cada gen housekeeping y cada aislamiento de secuencias se define por los alelos de 7 genes. Esto resulta en un perfil alélico o secuencia tipo (ST). Por ejemplo, el clon reconocido como Ibérica tiene un perfil MLST 3-3-1-12-4-4-16, el cual se ha definido como ST247. Actualmente, la nomenclatura de las cepas MRSA se basan en el ST y en el tipo SCCmec; por ejemplo, ST247-MRSA-I, que es el clon que alberga el SCCmec tipo I. Por otra parte, la principal desventaja que posee el MLST es que su ejecución es laboriosa y requiere mucho tiempo comparado con otras técnicas.
• Tipificación SSCmec. En la actualidad, se cuenta con cuatro métodos distintos para la caracterización de SCCmec. Oliveira y de Lencastre86 desarrollaron una PCR múltiple para los tipos I-IV SCCmec. En esta técnica, se detectaban los loci mecA y otros seis diferentes. Asimismo, se ha empleado el análisis de PCR en tiempo real para caracterizar los tipos I-IV de SCCmec, con base en los genes del complejo mec y el ccr. No obstante, el propósito es ofrecer un método universal que ofrezca mayor homogeneidad a la hora de estudiar dicho cassette cromosómico. Por ello, Chongtrakool y colaboradores han propuesto una novedosa clasificación para la nomenclatura de SCCmec, basada en los genes ccr (indicando el número) y los complejos mec (indicados por una letra mayúscula). La aplicación de esta nomenclatura se observa en la propuesta que agrupa a los SCCmec en los tipos 1A (tipo I), tipo 2A (tipo II), tipo 3A (tipo III), tipo 2B (tipo IV) y tipo 5C (tipo V).
  

Espectrometría de masas (EM)

• MALDI-TOF. Numerosos estudios han demostrado en los últimos años las ventajas de la EM MALDI-TOF para la identificación bacteriana89. La mayoría de los estudios han reportado especificidades > 97% para la identificación de estafilococos, incluyendo CoNS a nivel de especie90. Para alcanzar esta alta especificidad, la calidad de la base de datos y la estandarización de parámetros variables, como las condiciones de cultivo, son cruciales. Una aportación que ha generado mucho interés por su utilidad clínica ha sido su utilización directamente sobre muestras clínicas (urocultivo sobre todo) o desde hemocultivo. En el primer caso, se ha usado combinado con diferentes métodos de cribado en infección urinaria con buenos resultados. Dos estudios recientes demuestran que la introducción de la EM MALDI-TOF sobre hemocultivos positivos, acorta la identificación del microorganismo implicado en 1,45 días, reduce los costes globales del diagnóstico en un 56,9%94 y puede llegar a reducir la estancia media 2,5 días, y el coste por paciente en un 40%95. Una de las limitaciones iniciales de la EM MALDI-TOF ha sido su difícil aplicación a la determinación de la sensibilidad a antimicrobianos. En numerosos casos, la rapidez ganada en la identificación no era posible traducirla al 100% en eficiencia clínica, al no disponer de un sistema de estudio de sensibilidad a antimicrobianos que ofreciera una agilidad similar. Se han desarrollado métodos que permiten detectar la presencia de enzimas capaces de hidrolizar a determinados antimicrobianos, a partir del diferente cociente m/z generado por el antimicrobiano intacto y el hidrolizado, o la presencia de algunos mecanismos de resistencia, como vanB, a partir de la presencia de picos específicos96. Son estrategias que pueden ofrecer información útil y rápida respecto a grupos de antimicrobianos concretos, pero no podemos esperar obtener, mediante ellas, perfiles globales de sensibilidad. En muchos casos la resistencia a antimicrobianos está ligada a mecanismos no hidrolíticos, de modo que esta metodología puede permitir predecir resistencia, pero en ningún caso sensibilidad. Por otra parte, en el caso de determinados mecanismos de resistencia como las BLEE, la tendencia actual es a no considerar resistencia si no se alcanzan determinados niveles de CIM, aunque la enzima esté presente, con lo que la mera detección de hidrólisis, si esta no es cuantificable y extrapolable a CIM, no sería suficiente para emitir un informe de resistencia.

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Este artículo está basado en la tesina realizada por Cristina Muñoz Peña para el Máster en microbiología y enfermedades infecciosas realizado en Formación Alcalá.